2000年，李佳颖被易智言导演发掘并参与了电影《蓝色大门》的演员训练。2003年，在餐厅工作的李佳颖又被詹仁雄导演引荐给广告公司并正式开始了个人的演艺生涯。
2004年，李佳颖获得了台湾中视综艺节目《我猜我猜我猜猜猜》美少女选拔单元的冠军。
2005年，李佳颖出演了个人的首部影视剧作品，她与林佑威、蓝正龙、杨玉欣共同主演了青春爱情剧《45℃天空下》[3];同年，李佳颖还出演了都市剧《极限烫衣板》。
2006年，李佳颖与明道、白歆惠、蒋怡合作出演了都市偶像剧《天使情人》；同年，李佳颖还在与柯淑勤、汪建民、孙兴共同主演的都市剧《米可，GO!》中饰演了坚强开朗的女主角黄少萱，李佳颖也凭借此剧获得了亚洲电视节最佳女演员和第41届台湾电视金钟奖最佳女主角两项提名。